答案是:测序技术

测序技术的发展

第一代:桑格测序

第一代测序技术主要是基于桑格双脱氧终止法的测序原理，结合荧光标记和毛细管阵列电泳技术，实现测序的自动化。基本方法是链终止或降解法，人类基因组计划是基于第一代测序技术。

第一代Sanger测序技术的优点是测序阅读长度可达800-1K bp，测序时间短，完成一次测序仅需几十分钟，测序准确率高达99.999%，仍是测序的金标准。缺点是通量低，成本高，影响其真正大规模应用。

所以第一代测序技术并不是最理想的测序方法。经过不断的技术发展和完善，以罗氏的454技术、Illumina的Solexa、Hiseq技术和ABI的Solid技术为标志的第二代测序技术诞生了。第二代测序技术大大降低了测序成本，大大提高了测序速度，并保持了较高的准确性。以前完成一个人类基因组的测序需要三年时间，而第二代测序技术只需要一周，但序列读取长度比第一代测序技术短得多。

第二代:高通量测序(NGS)

高通量测序技术(又称下一代测序，NGS)始于454公司2005年基于焦磷酸测序的第一台第二代测序仪，2017年Illumina推出NovaSeqTM系列。高通量测序技术已经经历了十几年的技术发展，NGS测序平台也经历了一系列的收购和合并。最终形成了三个主要的测序平台，包括Illumina的Solexa平台、Life Technologies的Ion Torrent平台和华大基因的全基因组平台。1.Illumina平台是目前应用最广泛的NGS平台，因为其技术成熟，平台间的高度互补性和交叉性，使其在短阅读和长测序方面占据优势。目前占据了音序器市场70%左右的市场份额。2.生命科技平台生命公司的离子洪流测序平台采用半导体测序原理，对非均聚物的测序精度与其他NGS平台相差无几，但对连续碱基的检测还不够完善，检测连续碱基数量时可能会有误差。与其他平台相比，测序吞吐量更小，平台数量更少。

第三代:单分子/纳米孔测序

在过去的两年里，测序技术达到了一个新的里程碑。Helicos公司的Heliscope单分子测序仪、太平洋生物科学公司的SMRT技术和牛津纳米孔技术公司的纳米孔单分子技术被认为是第三代测序技术。与前两代技术相比，它们最大的特点是单分子测序，不需要PCR扩增。其中，Heliscope技术和SMRT技术利用荧光信号进行测序，而纳米孔单分子测序技术利用不同碱基产生的电信号进行测序。由于第二代技术存在阅读长度短、耗时长的缺陷，人们希望第三代测序技术能够解决这些缺陷。第三代测序技术利用现代光学、高分子、纳米技术等手段，区分碱基信号差异的原理，达到直接读取序列信息的目的。第三代测序设备在读取DNA序列片段长度方面优于第二代设备，但其准确性不如第二代设备。目前还没有完全成熟，市场应用也不广。随着未来技术的提高，

第三代测序的优势:

1)第三代基因测序的读取长度较长，如太平洋生物科学公司的PACBIO RS II的平均读取长度为10kb，可以降低生物信息学中的拼接成本，节省内存和计算时间。

2)直接对原始DNA样本进行测序，原则上避免了PCR扩增带来的误差。

3)拓展测序技术的应用领域，第二代测序技术多以DNA为基础，第三代测序有两个第二代测序没有的应用:第一是直接测量RNA的序列，RNA的直接测序将大大减少体外逆转录带来的系统误差。第二种是直接测量甲基化的DNA序列。实际上，DNA聚合酶复制A、T、C、G的速度不同。正常C或甲基化C为模板，DNA聚合酶的停顿时间不同。根据这个不同的时间，可以判断模板C是否甲基化。

4)第三代测序在ctDNA和单细胞测序方面有很大优势:ctDNA含量很低，第三代测序技术灵敏度高，可以监测到小于1ng在单细胞层面:第二代测序需要提取DNA并断裂进行测序，第三代测序直接对原始DNA进行测序，细胞裂解原位测序是第三代测序的杀手级应用。

第三代测序缺陷:

1)总体来看，单次读取长度的错误率仍然偏高，成为限制其商业应用的重要原因；目前第三代基因测序技术的误差率为15%-40%，远高于NGS第二代测序技术的误差率(小于1%)。幸运的是，第三代的错误是完全随机的，可以通过覆盖来纠正(但这会增加测序成本)。

2)第三代测序技术依赖于DNA聚合酶的活性。

3)成本高。第二代illumina测序成本为每100万碱基0.05-0.15美元，第三代Illumina为每100万碱基0.33-1.00美元。

4)信函分析的软件不够丰富。

与第二代测序相比，第二代测序技术的优点是成本大大降低，通量比第一代大大提高，但缺点是引入的PCR过程会在一定程度上增加测序误差率，具有系统偏倚，阅读长度也比较短。第三代测序技术是为了解决第二代的缺点而开发的。其基本特征是单分子测序，不需要任何PCR过程。这是为了有效避免PCR偏倚引起的系统误差。第三代读数长度很长，精度低，成本高。然而，由于较长的阅读长度，有利于组装和寻找独特的阅读，具有明显的潜在优势，但缺点也限制了第三代测序的商业应用。未来前景目前，第二代基因测序技术高通量测序(NGS)是商业化市场的主流。未来第三代单分子/纳米孔测序将是大势所趋，但预计未来5-10年第二代和第三代基因测序将并存，但第二代测序仍将是测序市场商业应用的主流。