▲第一作者：Anand Saminathan
通讯作者：Yamuna Krishnan
通讯单位：美国芝加哥大学
DOI: https://doi.org/10.1038/s41565-020-00784-1
由于缺乏合适的工具，膜电位在大多数细胞内细胞器的作用仍未被探索。
● 在此，作者介绍了Voltair，一种荧光DNA纳米器件，它可以报告绝对膜电位，并且可以靶向活细胞中的细胞器。
● Voltair包括一个电压敏感荧光团和一个用于比率测定的参考荧光团，并作为内吞示踪剂。利用Voltair，作者可以在活细胞中原位测量不同细胞器的膜电位。
● Voltair可以潜在地指导生物相容电子学的合理设计，并增强我们对膜电位如何调节细胞器生物学的理解。
伏特静息膜电位的设计和表征
通过两个电极之间的电势差来测量的:一个插入生物膜的样品电极和一个位于膜外的参考电极。伏尔泰使用了类似的概念，将插入生物膜的报告探针的荧光与位于生物膜外不同波长的参考探针的荧光进行比较。
▲图1 电压探针的设计与表征。
a，伏特计工作原理示意图:测量探针(G，绿色)是一种电压敏感染料(RVF)结合到一个DNA双链，该双链是通过附着在一个脂质锚(POPE)上膜拴着的。参比探针(R，红色)是一个DNA双链与参比染料(Atto647N，红色球体)一起与RVF报告膜电位比率。
b，RVF (RVF-N3)和脂质锚定POPE的可接合版本的结构。
c，显示RVF与Atto647N荧光强度(G/R)像素比的伪彩色图像。
d, HEK 293T细胞中电压PM(灰色痕迹)和未修饰RVF(红色痕迹)作为质膜电位的传感器响应。插图:电压PM( (黑色)和未修改RVF(红色)从0到100 mV的信号变化百分比(SC)。
e、f静息细胞(Res)细胞膜的绝对G/R值和夹住细胞电压在100mv和+ 100mv时的值。
靶向VoltairIM到特定内吞细胞器的膜
接下来，作者利用清道夫受体介导的内吞作用将VoltairIM靶向到溶酶体内途径的细胞器上。基于DNA的探针可以标记表达清道夫受体的不同细胞类型中的特定内吞细胞器。由于HEK 293T细胞不表达清除剂受体26，我们通过瞬时转染在HEK 293T细胞中过表达融合到CFP的人巨噬细胞清除剂受体(hMSR1)。这导致了VoltairIM的有效内部化。hMSR1-CFP与VoltairIM的共定位和竞争实验表明，VoltairIM的摄取是由清道夫受体介导的。
▲图2 将VoltairIM靶向于特定的内吞细胞器膜。
a、靶向策略示意图：VoltairIM通过结合清道夫受体进行清道夫受体介导的内吞作用。细胞内吞VoltairIM以时间依赖的方式从质膜到早期内质体、晚期内质体和溶酶体。
b、转染hek293t细胞的内化VoltairIM（红通道）与人巨噬细胞清除剂受体（hmsr1cfp，绿色通道）之间的典型共定位。
c、在有无mBSA（30当量）的情况下，细胞内VoltairIM摄取的标准化强度，误差条表示n=30个细胞的三个独立试验的平均值±s.e.m。
d、不同内吞细胞器标记物（绿色通道）和VoltairIM（红色通道）在指定的追逐时间内的代表性共定位。早期内切体用转铁蛋白alex546（Tf）标记，晚期内切体用rab7mrfp（Rab7）标记，溶酶体用TMR葡聚糖（右旋糖酐）标记。
e、Voltair共定位（CL）的Pearson相关系数（PCC）与d中相应的内吞标记物以及像素位移（PS）。
原位测量绝对溶酶体膜电位
首先，作者验证了VoltairIM在溶酶体中的作用，从电生理学给出了广泛的经验知识。将hk293t细胞中VoltairIM标记溶酶体的G和R通道中的荧光图像转换为G/R图像，从中可以获得G/R分布。考虑到腔为阳性，胞质面为阴性，溶酶体膜电位为+114mv。这与不同细胞类型的电生理学一致。
▲图3 VoltairIM测量溶酶体膜电位。
a、用VoltairIM标记的放大溶酶体的电压钳位示意图。
b、 假彩色图像显示在溶酶体内部小叶上标记的VoltairIM的像素G/R比，作为整个溶酶体电压钳位施加的膜电位的函数。
c、VoltairIM灰色迹线，正方形）和VoltairIM（红色迹线，圆圈）的传感器响应作为膜电位（PMP，质膜电位；IMP，细胞内膜电位）的函数。插图：VoltairPM（黑色）和VoltairIM（红色）信号在c中从0到100 mV的百分比变化。
d、 不同细胞型VoltairIM标记溶酶体的代表性伪彩色G/R图像。
e、 在V-ATP酶抑制剂巴菲罗霉素（Baf-A1，500 nM）、mTORC1抑制剂Torin-1（1μM）、TRPML1激活剂ML-SA1（20μM）和Slo1激活剂NS1619（15μM）存在下，测定COS-7、RAW 264.7、BHK-21细胞的溶酶体静息膜电位值（VLy）和HEK 293T值。
f、 在VoltairIM标记的溶酶体（红色轨迹）和VoltairIM标记的内体（蓝色轨迹）中，ΔVmem与TRPML1激活时间的时间推移图。
总结：
本文证明了Na+或K+在建立早期内体高膜电位中的作用。再生内膜和质膜表现出相似的电化学特性。先前假设可以忽略不计的跨高尔基体网络的膜电位实际上与溶酶体40的膜电位一样高；然而，它并不是完全由V-ATPase驱动的。通过非侵入性测量细胞器中的膜电位，作者可以测试膜电位是如何调节细胞器功能的。
原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41565-020-00784-1
