相信做过质粒构建的同学应该都很容易看明白shRNA的设计过程，如果还不懂的，可以参考以下两篇文章看看：
1. shRNA序列设计：从载体结构到设计操作案例
2. 知识分享：手把手教你设计shRNA
随便插个图，装的高逼格一点↑
看完之后，我来给大家分享一下这两天设计shRNA时遇到的一个疑难杂症（或许是因为我基础差的缘故），一个特殊内切酶BsaI引起的困惑！
起初，我认为是单酶切，然后隔壁老张也说了单酶切的缺陷：没有方向。再然后我就蒙圈了.......难不成那么多文献里面报道的方法里面给的shRNA序列都错了？虽说都是低分的期刊，但是我相信还不至于那么多不靠谱的研究者都出现了同样的错误。虽然最近很忙，但是我还是想硬刚一下。于是我开始四处寻医，问了好些人后，最终从代理商那得到伦理一个关键信息：BsaI单酶切竟然TMD能起到双酶切的效果！大牛们请原谅我的大惊小怪... 接下来我详细记录一下此次过程，便于将来有需要的小伙伴参考。
装逼×2↑
我们要设计的是一个靶向人PROK1的shRNA，根据最上面链接中的方法得到的序列（5'-3'）如下：
CCGG CTCCATGGACTTGAAGAACATCTCGAGATGTTCTTCAAGTCCATGGAG TTTTTTG，其中CCGG的内切酶AgeI的酶切位点（识别并切割A^CCGGT）；下划线为最终发挥靶向目的基因作用的特异性siRNA序列；加粗字体为茎环（loop）序列，注意这个茎环序列有点个性，本身也能反向互补，看着也挺迷惑人的；CTCGAG后面的则是与siRNA反向互补的序列；最后的TTTTTTG是为了保证shRNA转录出来后其末端有连续的4个U而设计的。
如果粘性末端设计为CCGG，那么必须要求质粒上有能被识别并且留下粘性末端为CCGG的酶切位点，据我所知也就是AgeI了：A^CCGGT。然鹅...我们现有的质粒上并没有！只有BsaI酶切位点！而且，很多文献中报道的粘性末端也不是CCGG，而是CACC，但是人家却是声称用的是BsaI单酶切。这是咋回事？我再次仔细看了BsaI的酶切特点，结果发现，它的识别序列和切割序列原来是两个概念！即，识别序列为：GGTCTC；切割序列为：GGTCTCN^NNNN，N为任意碱基。如下图所示：
因此，我们可以推测，已发表文献中CACC不是双酶切后留下的粘性末端，而是BsaI单酶切产生的效果，也就是说上图中切掉的那四个N正是CACC。同样，另外一端留下来的粘性也是该质粒特异性的序列。
综上，在我们这个特殊质粒的情形下，PROK1 shRNA的sense序列应该是下面第一行这样：
其他的也不多说了，说多了容易错，装逼被发现会遭雷劈的。
