富集分析(Nat Comm: 一种基于协同可逆共价相互作用大规模糖蛋白分析富集方法)

婕珍

2022-04-20 17:16:24

大家好，今天跟大家分享一篇发表在Nat Comm上的文献，文章的题目为“Anenrichment method based on synergistic and reversible covalent interactions forlarge-scale analysis of glycoproteins”。该文的通讯作者为乔治亚理工学院的吴荣虎教授。吴教授课题组的主要研究方向是蛋白质翻译后修饰，细胞代谢等。

蛋白质的糖基化修饰是生物中普遍存在且重要的一种翻译后修饰。蛋白质的糖基化在蛋白质折叠、细胞信号转导、肿瘤转移等许多方面发挥了重要作用。异常的糖基化会引起肿瘤、传染病等。因此，蛋白质糖基化的整体分析对于理解糖蛋白的功能以及识别糖蛋白作为生物标志物和药物靶标是至关重要的。然而，由于聚糖的微观不均一性和低丰度的特点，使得复杂样品的糖蛋白分析变得非常有挑战性。现有的复杂生物样品的蛋白质糖基化分析主要包括凝集素、硼酸富集、肼化学法和亲水相互作用色谱法（HILIC）。这些方法各有优缺点。比如，HILIC可以基于材料的亲水性富集糖肽，但是该方法的选择性会比较低而富集到亲水的非糖肽；硼酸富集方法通过与糖肽中聚糖的可逆共价相互作用实现富集，但是这一方法的相互作用较弱，导致低丰度的糖肽不够有效的富集。针对这些问题，该文合成了一种硼酸衍生物偶联的树突状聚合物磁珠被并通过协同作用来富集糖肽的方法。

图1

由于硼酸与聚糖的相互作用较弱，难以富集低丰度糖蛋白。因此，作者首先尝试使用不同的硼酸衍生物来增强硼酸与糖肽的相互作用。本文中使用到的硼酸衍生物主要有图1中的5种，并使用相同量的HEK293T细胞蛋白分别对它们糖肽富集的效果进行了表征。已有研究报道糖与衍生物II的结合能力要比苯硼酸的强：衍生物II与果糖的结合常数（Ka）为606M-1，而苯硼酸与果糖的结合常数仅为79M-1。实验结果发现，衍生物II的糖肽富集效果在5种硼酸衍生物中最好。因此，作者对基于衍生物II的糖肽富集和特异性进行了优化。

图2 图2

在选好与糖肽结合能力强的硼酸衍生物后，作者对协同效应增加糖肽覆盖率进行了研究。协同效应是如何实现的呢？我们知道，糖肽中的聚糖含有多个单糖，这也就有可能一个糖肽与多个硼酸分子相互作用。为了增加协同作用的机会，他们在磁珠上进行了树状聚合物的合成，然后将硼酸衍生物与聚合物结合，树状聚合物的循环次数对于结合硼酸衍生物具有重要影响，因此作者对聚合物的合成轮数与糖肽富集效果进行了探讨（图2）。如图2c所示，在第四个聚合物合成循环时，后续的糖肽富集效果就没有太大的增加，即继续增加轮数对于协同效应的影响不是很大。此外，由于富集条件相对温和，延长富集时间对于糖肽富集没有什么负面影响。

为了测试合成的聚合物硼酸衍生物（DBA）的糖肽富集效果，作者将其与凝集素富集法和商品化的ZIC-HILIC法进行了比较（图3）。实验结果表明，DBA法富集到的特异性糖肽是三者中最多的，在特异性上DBA也是三者中最好的；而ZIC-HILIC富集到的糖肽比凝集素法要多，但是在特异性上要比凝集素法要差。作者分析这可能是因为一些亲水但非糖基化的肽也可以被HILIC富集，降低了其富集的特异性。

图3

在验证了DBA法的优势之后，作者将其应用于酵母细胞N-和O-糖基化修饰糖肽的富集（图4）。在两次重复实验中，总共鉴定到501个糖蛋白中的1044个N-糖基化肽段（图4a）。为了说明该方法可以富集低丰度糖蛋白，作者比较了已鉴定的N -糖蛋白和全酵母蛋白组中所有蛋白的丰度分布，发现它们非常相似（图4b）。与传统的硼酸富集法相比，DBA法多富集到了近一倍的低丰度糖蛋白——每个细胞中拷贝数少于2000个（158 vs.84）。

酿酒酵母中的O-糖基化主要是单一的甘露糖修饰，但是甘露糖修饰的数目各不相同。因此，作者使用了高能碰撞裂解（HCD）模式并优化了几个重要的仪器参数来增加鉴定的准确度。通过两次重复实验，共鉴定到234个糖蛋白，覆盖率都在80%以上。甘露糖个数在O-糖基化中的分布为1-10个（图4c）。

图4

由于聚糖结构的多样性，全面分析哺乳动物细胞和组织的糖蛋白更具有挑战性，本文对MCF-7、HEK 293T和Jurkat三种细胞和小鼠脑组织糖蛋白进行了分析，分别鉴定到2340、3052、2120和4195个糖基化位点。并且通过与仅缀合benzoboroxole的磁珠富集相比，DBA法能够鉴定到更多的糖肽（88%）和糖蛋白（79%）（图5）。

图5

此外，作者还将该方法用于O-GlcNAc糖基化蛋白的鉴定（图6）。常规硼酸富集法富集O-GlcNAc糖基化蛋白是非常具有挑战性的，因为只有一个糖（GlcNAc）结合到丝氨酸或苏氨酸上，并且这种糖不存在顺式二醇结构。尽管硼酸富集法也可以不通过顺式二醇与糖作用，但是该相互作用很弱，因此富集效率很低。通过DBA法，从HEK293T细胞中共鉴定到510个糖肽，与之相对应的是，常规硼酸法仅富集到18个糖肽。作者猜测富集效率的显著提高可能与DBA的协同作用有关。